科研笔记📒｜过表达质粒转染步骤与成功关键

🌟网上都是教大家🤣如何正确按照SOP操作的，在亲身经历过这个实验之后，我来给大家分享一些我自己经历过的感受与经验。 - 🈚️首先过表达的原理就是基因转化到目标细胞中，使细胞产生大量的蛋白质或者编码的目的基因，这个原理大家必须要知道！！ 准备： 1⃣️细胞：悬浮细胞（如jurkat）难度小于贴壁细胞（如293），传代难度大于原代，PBMC转染难度超级高。 2⃣️转染试剂：lipo3000（我优先考虑，如果后期不行，建议大家电转就是死的太多了）分成A和B液（红和黄帽子） 3⃣️质粒：我选用的是擎科生物合成 4⃣️培养基选的1640/DMED - 步骤： 1⃣️可以根据说明书去配置细胞的比例，比如说我做的时候是24孔板，大约0.5-2*10”⑹ ❗️浓度也要控制好，太浓了转效率会下降，太稀了lp3000有毒性全都死了 3⃣️ 在转染前1天，使用胰酶消化处于对数生长期的细胞，以合适密度接种于细胞培养皿或培养板中，确保转染时细胞汇合度达到70%-90%。 4⃣️取两个ep管，一个加入1:20lipo3000:MEM，另外一个加入我0.4:0.8:20质粒：p3000：MEM（MEM相同，剩下的按照比例来），然后将2液加入1液常温抚育20min 5⃣️加入后大概6-8h给细胞换液，再放24h可以加入刺激或者药物类。 6⃣️检测mRNA转染成功的金标准是pcr，检测蛋白成功用wb或者流式细胞仪。 — 实验成功的关键： 质粒构建非常重要，自己做太耗时也不一定顺利，后来尝试外包给擎科生物，发现效率高多了，响应及时，交付快。最近他们又升级了服务，自然日交付，就是说周末也正常生产，速度更快了，比其他家周末节假日延迟的情况方便很多，省了不少等待时间 🌟其实我个人选择他家的主要原因还是因为快，毕竟等待质粒的时间真的很煎熬，细胞不是在-80冰冻就是在穿代🤣 有需求的朋友们可以去看看呀！ 2⃣️一定要控制好转染试剂的用量防止毒性，抚育的时间控制在20分钟左右