现在跑电泳基本可以做到背景很干净，条带也很清晰～也很少做重复实验了，一批样品就可以跑出干净的条带… ➡️分享一下小经验，wb从样品制备到发光整个流程的注意事项请看P2和P3～😘 👇🏼下面是一些重点关注的问题： ‼️其实主要就是两点：信噪比，也就是信号强，噪音低。（背景，非特异性结合低） ‼️信号强： ➡️1、蛋白样品浓度一定要足够，一般上样20-30ug，不好跑的蛋白可以到50ug，例如磷酸化蛋白。 ➡️2、保证蛋白质量够的同时，上样量要少，1.0-15孔的板最好不要超过12ul，1.5-15孔的板最好不要超过15ul，我一般只上6～8ul。 ➡️3、每个孔上样量要一致❗️如果因为调内参导致上样量有差别，那就补齐，用loading给上样少的补到一样体积！！（具体操作和说明看之前的笔记） ➡️4、NB老师的跑胶大法非常好，先10v跑20min，再开始85v跑上层，130v跑下层。（自制胶，预制无需考虑这个问题） ➡️5、转膜小分子蛋白用0.22的膜，理论上1kd 1min，比理论上再多10min即可，恒压90v或恒流300mA都可以。 ➡️6、敷一抗：两张膜可以背靠背孵育，如果抗体量大的话敷的很均匀，抗体量小不建议背靠背孵育。 🉑ps ：一抗的选择很重要❗️如果不知道选择什么牌子的一抗就去查CiteAb这个很好用～或者别的查抗体网页，之前我也出过合集以及教如何使用，煮页自己搜。 ‼️噪音低： ➡️1、封闭时间要够，脱脂奶粉1h起步，冬天到了起码1.5h，不要用析出的奶粉，磷酸化蛋白用BSA或者快封封闭，封闭完空洗膜10min再敷一抗！会干净很多。 ➡️2、洗膜的时候一抗洗久一点，二抗正常洗，另外，一抗4度过夜孵育比常温孵育效果好，4度孵育最好超过9个小时。 ➡️3、二抗常温孵育1h即可，冬天1.5h，不好孵育的蛋白可适当延长时间。 ➡️4、曝光，一定要选择好用的发光液，如果信号很强，建议稀释发光液，用1*TBS稀释就行～太强有时候反而会掩盖趋势。 最后：东方女人必定战胜西方印迹