今天给大家分享一篇莱顿大学Nathaniel I. Martin和Mario van der Stelt团队在Journal Of The American Chemical Society上发表的题为“Chemical Proteomics Reveals Antibiotic Targets of Oxadiazolones in MRSA.”的研究论文。作者联合表型筛选和化学蛋白质组学方法，发现了新的抗MRSA抗生素及其相互作用蛋白。
译名：化学蛋白质组学揭示MRSA中的抗生素靶点
期刊：Journal Of The American Chemical Society
IF：15.0
发表时间：2023.1.18
研究背景：
细菌耐药性和新型抗生素的缺乏对全球健康构成了严重威胁。在革兰氏阳性菌中，由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的感染导致全球75万人死亡，迫切需要具有新作用模式（MoAs）的抗生素以降低抗生素耐药性问题。在传统的药物发现研究中，基于靶点的筛选通常用于识别小分子，但这种策略不太适用于抗生素的发现。表型筛选是一种新型的研究方法，可以通过新的MoAs来识别抗生素。
研究结论：
活性化合物的表型筛选
研究人员首先根据结构多样性、类药物性质等特点，构建了包含352个小分子的文库。使用100μM测试该化合物对MRSA的抗菌活性，其中25个化合物对细菌生长具有抑制作用(图1A)。随后，研究人员确定了每种化合物的最低抑制浓度(MIC)，从中获得最有效的原始化合物1（MIC为6.25 μM）。该化合物的噁二唑酮部分，被报道能与酶中具有催化活性的丝氨酸和半胱氨酸残基发生共价反应(图1B)。为了为了进一步地确定其构效关系并优化其效价，研究人员合成了61个衍生物并进行抗菌活性测试。化合物2具有类似抗菌活性的结构支架，对2进行修饰后(图1C)，发现其抗菌活性（化合物3）比化合物1提升了16倍。
图1 (A)从初始筛选到先导化合物3的流程图 (B) 1,3,4-噁二唑-2-酮衍生物与活性丝氨酸和半胱氨酸的反应机理 (C) 噁二唑酮合成的路线
化合物3对多种临床分离株具有高度活性，包括万古霉素耐药株(表1)。在106CFU/mL浓度下，化合物3在24小时内能杀死99%的细菌(图2A)。此外，化合物3还具有较低的细胞毒性。接着研究人员制备了化合物3的耐药菌株-MRSA USA300，在亚MIC浓度的情况下连续传代4周后产生耐药突变(图2B)。相比之下，临床使用的脂肽类抗生素达托霉素的耐药性出现得更慢，这与之前的报道一致。
图2.(A)化合物3对MRSA USA300的杀伤率 (B)MRSA USA300在0.25×MIC浓度的耐药性
基于活性的化学蛋白质组学分析
基于噁二唑酮类化合物与蛋白的共价反应机制，研究人员用炔基取代化合物3的间苯氧基，形成活性探针4(图3B)。将处于指数期的MRSA细胞用化合物3或DMSO处理，然后用探针4标记，探针标记的蛋白质通过铜催化叠氮化物−炔点击化学连接到含有Cy5荧光基的叠氮化物上。利用竞争性ABPP实验，研究人员鉴定到10个潜在的相互作用蛋白 (图3C)。
图3 (A)使用SDS-PAGE或质谱仪揭示MRSA上的原位竞争性ABPP工作流程 (B)探针4的结构式 (C)基于凝胶的竞争性ABPP (D)MS数据比较
耐药机制的研究
接下来进行靶点验证，研究人员筛选了8个MRSA转座子突变体的探针标记蛋白质组，这些突变体缺乏编码已鉴定的任一靶蛋白的基因(图4A，C)。荧光条带显示探针4标记了AdhE、FphB、FphH、FI2、HZ1和FphE，但未标记FphC和HH9(图4B)，可能是因为基于凝胶的ABPP的分辨率较MS低。
图4 (A)用探针4标记MRSA USA300转座子突变体 (B)用探针4处理的野生型(WT)MRSA USA300 (C)FphE转座子突变体的标记
为了评估哪些靶蛋白与抗生素效应有关，研究人员比较了三个非活性衍生物(5~7)和三个活性化合物(1~3)的相互作用图谱(图5A)。在探针1处理后，观察到FphB的强标记，而其他化合物没有观察到。在探针3处理下，探针4不显著标记F12、IB7、HH9和HZ1，却与非活性化合物5、6或7结合。FphE和FphH在10μM下被所有化合物强烈标记。表明探针3的抗菌活性与FphB、IB7、HH9、F12、FphE、FphH或HZ1的特异性抑制无关。
由于FabH的转座子突变体不能存活，但与Oxa2（一种FabH特异性抑制剂）的联用，能有效杀灭细菌，表明抑制FabH活性可能有助于提高噁二唑酮类化合物的生物活性。对于FphC和AdhE，观察到一种或多种活性化合物的标记，而不被非活性类似物的标记(图5B)。表明多个靶点(FphC、AdhE和FabH)在噁二唑酮的抗菌活性中发挥作用。
图5 (A)活性化合物1~3及非活性化合物5~7的靶标蛋白 (B) 活性化合物3和非活性化合物5、6、7之间抑制蛋白的交集 (C) WT与抗化合物3的抗性菌株的蛋白水平比较
文章总结
本文发现噁二唑酮类化合物作为一种新的化学类型，对包括耐药菌株在内的金黄色葡萄球菌具有抗生素活性。作者使用基于活性的探针阐述了噁二唑酮类药物的多药理作用模式，并在MRSA中确定了它们的靶点，初步解释了噁二唑酮类药物在MRSA的药理作用模式。本文展示了化学蛋白质组学在挖掘抗生素候选药物中的价值。
